Accurate identification of atypical Staphylococcus chromogenes plasma-clotting strains causing bovine mastitis / Identificação acurada de cepas atípicas de Staphylococcus chromogenes que coagulam o plasma envolvidas com mastite bovina

ABSTRACT: We compared the potential of routine techniques used for the identification of Staphylococcus species, aiming to evaluate their accuracy in the detection of 43 Staphylococcus chromogenes strains isolated from bovine mastitis that, despite being a coagulase-negative species, are able to clot plasma. These strains could be mistakenly suspected to be S. aureus and lead to an unappropriated treatment of the disease. MALDI-TOF, PCR-RFLP of the chaperonine gene groEL, and sequencing of the 16S rRNA and elongation factor Tu gene tuf were employed. Results from the four methods were coincident for only half of the strains because of the low accuracy of the groEL PCR-RFLP (51.2% accuracy). Even though all the sequencing results were identical, the high accuracy of the MALDI-TOF results (97.7% accuracy, with only one strain misidentified) encourage the use of this technique, since it does not require laborious sample preparation, being fast and simple to perform.

RESUMO: Nós comparamos o potencial de técnicas rotineiras utilizadas para a identificação de espécies de Staphylococcus, com o objetivo de avaliar a acurácia delas na detecção de 43 isolados de Staphylococcus chromogenes envolvidos com mastite bovina que, apesar de ser uma espécie coagulase-negativa, são capazes de coagular o plasma. Essas cepas poderiam ser erroneamente suspeitas de serem S. aureus e levarem a um tratamento não adequado da doença. MALDI-TOF, PCR-RFLP do gene da chaperonina groEL e sequenciamento do gene do rRNA 16S e do gene do fator de elongação Tu, tuf, foram avaliados. Os resultados dos quatro métodos foram coincidentes para apenas metade das cepas, devido à baixa precisão da PCR-RFLP com groEL (51,2% de acurácia). Apesar de todos os resultados do sequenciamento serem idênticos, a alta precisão dos resultados do MALDI-TOF (97,7% de acurácia, com apenas uma cepa identificada incorretamente) encoraja o uso dessa técnica, pois, não requer preparação laboriosa de amostras, sendo rápida e simples de executar.

Relationship between total bacteria counts and somatic cell counts from mammary quarters infected by mastitis pathogens / Relação entre contagem total de bactérias e contagem de células somáticas de quartos mamários infectados por patógenos da mastite

This study was conducted to establish the relationship between somatic cell count (SCC) and bacterial shedding from mammary quarters according to mastitis pathogens. Milk samples from 638 mammary quarters were examined for mastitis pathogens, SCC and total bacterial count (TBC). The raw data of SCC and TBC were used to perform descriptive statistics. The significance of the arithmetic mean differences between SCC and TBC according to bacteriological examination results was determined by a two-tailed unpaired t-test. Pearson and Spearman´s correlations were done with logarithmic data and linear regression analyses. The geometric means of the bacteriological examination results were (cells mL-1; CFU mL-1): no growth (52,000; 12,000), coagulase-negative staphylococci (85,000; 17,000), Staphylococcus aureus (587,000; 77,000); other streptococci (432,000; 108,000) and Streptococcus agalactiae (1,572,000; 333,000). The Pearson and Spearman's correlations between SCC and TBC were higher than 0.60 for all mastitis pathogens. The regression analyses slopes showed different increase in TBC with the same increase in SCC according to mastitis pathogens. The slope for S. agalactiae (0.542) was higher than that for other mastitis pathogens. The results suggest that the intensity of inflammatory process was associated with number of mastitis pathogens shedding from the mammary gland.

Este estudo foi realizado com objetivo de estabelecer a relação entre contagem de células somáticas (CCS) e a liberação de bactérias de quartos mamários de acordo com os patógenos da mastite. Amostras de leite de 638 quartos mamários foram examinadas para identificação dos patógenos da mastite, CCS e contagem total de bactérias (CTB). Estatísticas descritivas foram utilizadas para avaliar os dados brutos de CCS e CTB. A diferença entre médias para CCS e CTB de acordo com os resultados dos exames bacteriológicos foi avaliada pelo teste T para amostras independentes. Foram realizadas a correlação de Pearson, de Spearman e regressão linear com os dados transformados. As médias geométricas de acordo com os resultados dos exames bacteriológicos foram (células mL-1; UFC mL-1): sem crescimento (52.000; 12.000), estafilococos coagulase negativo (85.000; 17.000), Staphylococcus aureus (587.000; 77000); outros estreptococus (432.000; 108.000) e Streptococcus agalactiae (1.572.000; 333.000). A correlação de Pearson e Spearman entre CCS e CTB foi maior que 0,60 para todos os patógenos da mastite. O coeficiente angular das regressões lineares mostrou diferentes aumentos da CTB como o mesmo aumento da CCS de acordo com os patógenos da mastite. O coeficiente angular para o S. agalactiae (0.542) foi maior em relação aos outros patógenos da mastite. Os resultados sugerem que a intensidade do processo inflamatório foi associada com a quantidade de bactérias da mastite liberada pela glândula mamária.

Uso de PCR e sequenciamento do rDNA 16S para identificação de bactérias do gênero staphylococcus isoladas de mastite bovina / Identification of staphylococcus strains isolated from bovine mastitis by PCR and 16S rDNA sequencing

O objetivo deste trabalho foi identificar espécies de Staphylococcus (n=100) isoladas de mastite em rebanhos bovinos do Estado de Minas Gerais. Para esta finalidade foram utilizadas reações de PCR empregando oligonucleotídeos iniciadores descritos anteriormente para amplificar genes específicos de S. aureus (femA), S. intermedius (rDNA 16S) e S. hyicus (rDNA 16S-23S) e o sequenciamento do rDNA 16S. De acordo com as reações de PCR, 83 isolados foram identificados como S. aureus, 13 isolados como S. intermedius, dois como S. hyicus e dois isolados não foram identificados. Foram submetidos ao sequenciamento do rDNA 16S seis isolados identificados como S. aureus e os 17 restantes. Os seis isolados identificados como S. aureus confirmaram essa identificação. Dos outros 17 isolados, 13 foram identificados como S. chromogenes e quatro como S. hyicus, com similaridade igual ou superior a 99%. Baseando-se nos resultados da reação de PCR do gene femA e do sequenciamento do rDNA 16S, foram identificados 83 S. aureus, 13 S. chromogenes e quatro S. hyicus. Neste estudo os oligonucleotídeos iniciadores empregados na reação de PCR para S. intermedius não foram específicos, pois amplificaram também S. chromogenes; e os empregados na reação de PCR para S. hyicus não foram sensíveis, pois falharam na identificação de dois isolados de S. hyicus. A identificação definitiva das duas últimas espécies somente foi possível pelo sequenciamento do rDNA 16S.

The objective of this study was to identify the species of 100 isolates of Staphylococcus from mastitis in dairy cows from herds located in the state of Minas Gerais, Brazil. PCR reactions were carried out using specific primers described previously for S. aureus (femA gene), S. intermedius (16S rDNA) and S. hyicus (16S-23S rDNA spacer region). In addition, products of amplification of variable regions of the 16S rDNA gene of the strains were sequenced. According to the results of the PCR, 83 strains were identified as S. aureus, 13 as S. intermedius, two as S. hyicus and two isolates were not identified. The sequencing of 16S rDNA was applied to 23 strains identified by PCR amplifications: six S. aureus and the strains identified as S. intermedius (n=13), S. hyicus (n=2) or not identified (n=2). The sequencing of 16S rDNA confirmed the six strains as S. aureus. The others 17 strains were identified as S. chromogenes (13 isolates) and S. hyicus (four isolates). Each sample was related to a specie according to the smallest E-value and highest similarity (≥ 99%). The identification of S. hyicus and S. chromogenes was accomplished only by 16S rDNA sequencing.

Composition and bulk tank somatic cell counts of milk from dairy goat herds in Southeastern Brazil / Composição e contagem de células somáticas no leite de rebanhos caprinos do Sudeste do Brasil

The milk composition and somatic cell count (SCC) are requirements for assessment milk quality and mastitis in goat herds. Studies conducted with dairy goat herds indicated that the milk composition differed among them to due to factors such as genetic, feeding, system of production, stage of lactation, year and year-season. The objective of this study was to assess SCC and other milk quality indicators (fat, protein, lactose, and total solids) for goat milk bulk tank. The influence of the herd and year-season on the milk composition as well as herd, milking system and year-season on SCC was also evaluated. Thirteen Brazilian dairy goat herds with about 1,400 dairy goats were included in the study. Six herds were milked by hand and in the remaining seven machine milking was used. Herds were sampled at weekly intervals during two lactations. A total of 913 bulk milk samples were analysed using a automated equipment. The general average percent values for fat, protein, lactose and total solids were, respectively,3.44, 2.95, 4.45 and 11.69. The effect of herd and season was significant for all milk components and bulk milk goat somatic cell count (SCC).The SCC average of all 13 herds was 779,000 cells/ml. The average SCC values of herds milked by hand and by machine were 1,121,000and 848,000 cells/ml respectively. In both groups, the SCC was lowerin the winter and higher in the autumn. Herd characteristics were responsible for higher variability on components and SCC in

A composição do leite bem como a contagem de células somáticas (CCS) são requisitos para avaliar a qualidade do leite e mastite em rebanhos caprinos. Estudos conduzidos indicaram que a composição do leite varia entre os rebanhos devido a fatores genéticos, alimentação, sistema de produção, estágio de lactação, ano e estação do ano. O objetivo do estudo foi avaliar a CCS e outros indicadores de qualidade(gordura, proteína, lactose e sólidos totais) no leite de rebanhos caprinos. A influência do rebanho e estação do ano sobre a composição bem como a influência de rebanho, tipo de ordenha e estação do ano sobre a CCS também foi avaliado. Treze rebanhos caprinos localizados no Brasil, com aproximadamente 1.400 matrizes foram incluídos no estudo, Sendo ordenhados manualmente e os outros sete com equipamento de ordenha. As amostras de leite dos rebanhos foram coletadas semanalmente durante duas lactações. O total de 913 amostras foi analisado no equipamento automatizado. A média dos valores percentuais para gordura, proteína, lactose e sólidos totais foram, respectivamente; 3,44; 2,95; 4,45 e 11,69. O efeito de rebanho e estação do ano foi significante para todos os componentes do leite e CCS. A média para CCS de todos 13 rebanhos foi 779.000 células/ml. As médias para CCS dos rebanhos ordenhados manualmente e mecanicamente foram, respectivamente, 1.121.000 e 848.000 células/ml. Em ambos grupos, a CCS foi menor no inverno e maior no outono. As características de rebanho foram responsáveis pela maior variação dos componentes e CCS no leite de rebanhos caprinos

Expression profile of genes associated with mastitis in dairy cattle

In order to characterize the expression of genes associated with immune response mechanisms to mastitis, we quantified the relative expression of the IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-γ and TNF-α genes in milk cells of healthy cows and cows with clinical mastitis. Total RNA was extracted from milk cells of six Black and White Holstein (BW) cows and six Gyr cows, including three animals with and three without mastitis per breed. Gene expression was analyzed by real-time PCR. IL-10 gene expression was higher in the group of BW and Gyr cows with mastitis compared to animals free of infection from both breeds (p < 0.05). It was also higher in BW Holstein animals with clinical mastitis (p < 0.001), but it was not significant when Gyr cows with and without mastitis were compared (0.05 < p < 0.10). Among healthy cows, BW Holstein animals tended to present a higher expression of all genes studied, with a significant difference for the IL-2 and IFN-γ genes (p < 0.001). For animals with mastitis no significant difference in gene expression was observed between the two breeds. These findings suggest that animals with mastitis develop a preferentially cell-mediated immune response. Further studies including larger samples are necessary to better characterize the gene expression profile in cows with mastitis.

Contagem, isolamento e caracterização de bactérias psicrotróficas contaminantes de leite cru refrigerado / Counting, isolation and characterization of psychrotrophic bacteria from refrigerated raw milk

Com os objetivos de quantificar, isolar e caracterizar bactérias psicrotróficas contaminantes de leite cru refrigerado, produzido na região da Zona da Mata de Minas Gerais e Sudeste do Rio de Janeiro, foram analisadas amostras de leite coletadas de 20 tanques coletivos e 23 tanques individuais. As contagens de bactérias psicrotróficas nas amostras de leite para os dois tipos de tanques de refrigeração variaram entre 10² e 10(7) Unidades Formadoras de Colônias (UFC) ml-1, porém, um maior número de tanques coletivos apresentou contagens acima de 1 x 10(5) UFC ml-1. Foi verificada a predominância de bactérias psicrotróficas gram-negativas (81,2 por cento), que foram identificadas pelos sistemas API 20E e API 20NE nos gêneros: Aeromonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Burkholderia,Chryseomonas, Enterobacter, Ewingella, Klebsiella, Hafnia, Methylobacterium, Moraxella, Pantoea, Pseudomonas, Serratia, Sphingomonas e Yersinia. As bactérias gram-positivas (18,8 por cento) foram identificadas com API 50 CH, API Coryne e API Staph, nos gêneros: Bacillus, Brevibacterium, Cellum/Microbacterium, Kurthia e Staphylococcus. Os sistemas API utilizados não identificaram todos os isolados bacterianos. Pseudomonas foi o gênero mais isolado e P. fluorescens foi a espécie predominante. A maioria dos isolados bacterianos apresentou atividade proteolítica e/ou lipolítica a temperaturas de refrigeração de 4ºC, 7ºC e 10ºC, evidenciando seu alto potencial de deterioração do leite e dos produtos lácteos. Os resultados ressaltam que maior atenção deve ser dada aos procedimentos que impeçam a contaminação do leite por esses microrganismos.

This study aimed to quantify, isolate and characterize psychrotrophic bacteria from refrigerated raw milk produced at the 'Mata' Region of Minas Gerais State and Southeast of Rio de Janeiro State, Brazil. Raw milk samples, were collected at the farms, from 20 collective refrigerated tanks and 23 individual refrigerated tanks. The psychrotrophic bacteria counting ranged from 10² to 10(7) Colony Forming Units (CFU) ml-1 for both types of refrigerated tanks, but most of the collective tanks showed counts higher than 1 x 10(5) CFU ml-1. Predominance of psychrotrophic gram-negative bacteria (81.2 percent), that were identified by API 20E and API 20NE as belonging to genera: Aeromonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Burkholderia, Chryseomonas, Enterobacter, Ewingella, Klebsiella, Hafnia, Methylobacterium, Moraxella, Pantoea, Pseudomonas, Serratia, Sphingomonas e Yersinia were oserved. The gram-positive bacteria (18.8 percent), were identified by API 50 CH, API Coryne and API Staph, to genera: Bacillus, Brevibacterium, Cellum/Microbacterium, Kurthia e Staphylococcus. The API systems utilized could not identify all the bacterial isolates. Pseudomonas was the genus most isolated with P. fluorescens as the predominant species. Most of the isolates presented proteolytic and/or lipolytic activity at 4ºC, 7ºC and 10ºC showing high potential for milk and milk products spoilage. The results indicated that more attention must be taken to the procedures necessaries to reduce milk contamination with psychrotrophic bacteria.

Epidemiological characterization of Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Porto Alegre (Rio Grande do Sul, Brazil)

One hundred strains of S. aureus isolated from bovine mastitis in Porto Alegre (Brazil) were analysed for biotype, phage pattern and ability to produce protein A. Biotype could be defined in 76 per cent of the isolates: 52 per cent belonged to biotype C (bovine origin) and 24 per cent to biotype A (human origin). Phage typing performed with the human basic set (Routine Test Dilution - RTD x 100) allowed the classification of 42 per cent of samples. Low titers of protein A were detectable in 89 per cent of the strains